Makalah Mikrobiologi
~Pengujian
Sallmonella Sp. Dan E. Coli~
Disusun Oleh
:
Ferisa
Lestari Nugrahayu
4 Kimia
Analis 2
(13)
SMK N 1 (STM
PEMBANGUNAN TEMANGGUNG)
BAB I
PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG
Mikroba
adalah salah satu makhluk renik yang menghuni hampir semua tempat baik di darat
(terresterial) maupun di perairan (akuatik), dan termasuk salah satu organisme
yang memiliki tingkat perkembangbiakkan luar biasa tinggi. Mikroba dapat
tinggal dalam suatu lingkungan yang mendukung kehidupanya, dari tempat yang
sederhana dan berlingkungan ‘nyaman’ sampai lingkungan ekstrim di dasar laut
dan di perut bumi. Salah satu tempat yang menjadi tempat suburnya mikroba
adalah makanan.
Makanan
adalah salah satu kebutuhan dasar bagi manusia, yang bisa diperoleh dari
berbagai sumber, dan dikonsumsi untuk memenuhi kebutuhan tubuh. Akan tetapi
–disadari atau tidak– makanan yang masuk ke tubuh kita juga memiliki potensi
untuk media masuknya cemaran penggangu kesehatan, dalam hal ini adalah
mikroorganisme (bakteri patogen, kapang, khamir dan dapat juga virus).
Mikroorganisme
yang mencemari bahan makanan berasal dari lingkungan sekitar, baik langsung
maupun tidak langsung. Hanya sebagian saja dari berbagai sumber pencemar yang
berperan sebagai sumber mikroba awal yang selanjutnya akan berkembang biak pada
bahan pangan sampai jumlah tertentu. Kemudian, bahan pangan yang tercemar
tersebut bisa menjadi media penularan sejumlah penyakit yang dibawa oleh
mikroorganisme tadi, misal Tuberkolusis (Dari Mycobacterium tubercolusa), disentri (E. Coli), dan tifus (Sallmonella
Typosa).
Dua
mikroorganisme yang paling umum menjadi biang masalah kesehatan adalah Sallmonella Sp. (genus bakteri
enterobakteria gram-negatif berbentuk tongkat yang dapat bergerak bebas dan
menghasilkan hydrogen sulfida), dan Escherischia
Coli (bakteri coliform yang sering ditemukan pada faces manusia dan hewan
berdarah panas, dan kadang-kadang menghasilkan pigmen berwarna
kuning). Seperti yang telah disebut di atas bahwa kedua mikroorganisme ini
menyebabkan penyakit disentri dan tifus. Penyakit-penyakit tersebut bisa
berakibat fatal kepada manusia, juga tidak menutup kemungkinan akan membawa kematian.
Untuk dapat
mewaspadai mikroorganisme-mikroorganisme ini, diperlukan adanya
identifikasi pada makanan yang sering dikonsumsi. Identifikasi dapat
berupa pengujian kualitatif dan kuantitatif dengan berbagai metode standart uji
mikrobiologi.
B. TUJUAN
- Untuk mengetahui dan memahami mengenai metode yang digunakan dalam
mengidentifikasi Salmonella dan E Coli dalam makanan
- Mengetahui langkah-langkah
dalam identifikasi Salmonella dan E.Coli.
BAB II
PEMBAHASAN
A. DEFINISI
1. Sallmonella
Sp.
Salmonella merupakan suatu genus
bakteri enterobakteria gram-negatif berbentuk tongkat yang menyebabkan tifus,
paratifus, dan penyakit foodborne. Spesies-spesies Salmonella dapat
bergerak bebas dan menghasilkan hydrogen sulfida. Salmonelladinamai
dari Daniel Edward Salmon, ahli patologi Amerika, walaupun sebenarnya, rekannya
Theobald Smith (yang terkenal akan hasilnya pada anafilaksis) yang pertama kali
menemukan bacterium tahun 1885 pada tubuh babi.
Berikut adalah klasifikasi dari Bakteri Salmonella :
Kerajaan : Bakteri
Kelas : Gamma
Proteobacteria
Order : Enterobacteriales
Keluarga : Enterobacteriaceae
Genus : Salmonella
Species : S.
enterica (Anonimb, 2009).
Salmonella adalah penyebab utama dari penyakit yang disebarkan melalui makanan (foodborne diseases). Pada
umumnya, serotipe Salmonella
menyebabkan penyakit pada organ pencernaan. Penyakit yang disebabkan oleh
Salmonella disebut salmonellosis. Ciri-ciri orang yang mengalami salmonellosis adalah diare, keram perut, dan demam
dalam waktu 8-72 jam setelah memakan makanan yang terkontaminasi oleh
Salmonella. Gejala lainnya adalah demam, sakit kepala, mual dan muntah-muntah.
Tiga serotipe utama dari jenis S. enterica adalah S.
typhi, S. typhimurium, dan S. enteritidis. S. typhi
menyebabkan penyakit demam tifus (Typhoid fever), karena invasibakteri ke dalam pembuluh darah dan gastroenteritis,yang disebabkan oleh
keracunan makanan/intoksikasi.Gejala demam tifus meliputi demam, mual-mual,
muntah dan kematian. S. typhi memiliki keunikan hanya
menyerang manusia, dan tidak ada inang lain.Infeksi Salmonella dapat berakibat fatal kepada bayi, balita, ibu hamil dan
kandungannya serta orang lanjut usia. Hal ini disebabkan karena kekebalan tubuh
mereka yang menurun. Kontaminasi Salmonella dapat dicegah dengan mencuci tangan
dan menjaga kebersihan makanan yang dikonsumsi.
2. E.Coli
E.Coli adalah
bakteri coliform yang sering ditemukan pada faces manusia dan hewan berdarah
panas. Organisme ini tersebar luas di alam biasanya lazim terdapat dalam
sel pencernaan manusia dan hewan. Dalam Merchant dan Parker (1961)
disebutkan spesies E. coli tidak dapat mengurangi asam sitrat dan
garam asam sitrat sebagai sumber karbon
tunggal dan tidak menghasilkan pigmen, tetapi
kadang-kadang menghasilkan pigmen berwarna kuning.
Klasifikasi
Escherichia coli :
Divisio :
Schizomycota
Kelas :
Schizomycetec
Ordo :
Eubacteriaceae
Genus :
Escherichia
Species
:
Escherichia coli (Salle, 1961)
E.
coli adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang yang tidak membentuk spora
yang merupakan flora normal di usus. Meskipun demikian, beberapa jenis E. coli
dapat bersifat patogen, yaitu serotipe-serotipe yang masuk dalam golongan E.
coli Enteropatogenik, E.coli Enteroinvasif, E. coli Enterotoksigenik dan E.coli
Enterohemoragik . Jadi adanya E. coli dalam air minum menunjukkan bahwa air
minum tersebut pernah terkontaminasi kotoran manusia dan mungkin dapat
mengandung patogen usus. Oleh karenanya standar air minum mensyaratkan E. coli
harus absen dalam 100 ml.
E.
coli tersebar diseluruh dunia dan ditularkan bersama air atau makanan yang
terkontaminasi oleh feses. Escherichia coli berbentuk batang, tebal
0,5µ m; panjang antara 1,0 - 3,0 µ m;
bervariasi dari bentuk koloid sampai berbentuk seperti filamen yang
panjang; tidak berbentuk spora; motil dan filamen
perithin beberapa galur tidak memiliki flagella; bersifat
Gram negatif (Merchant dan Parker, 1961).
E.
coli bersifat aerob atau kualitatif
anaerob, dapat tumbuh pada media buatan.
Beberapa sifat E. coli antara lain pertumbuhan optimum
pada suhu 37ºC, dapat tumbuh pada
suhu 15ºC - 45ºC, tumbuh baik pada pH 7,0
tapi tumbuh juga pada pH yang lebih tinggi (Merchant dan Parker,1961)
Koloni
terlihat basah, mengkilat, tidak bening,
bulat dan dengan tepi yang terlihat halus dan rata. Koloni muda terlihat
granuler halus dan makin tua
menjadi granuler kasar. Escherichia
coli menghasilkan asam dan gas dari glukosa, laktosa, fruktosa, maltosa,
arabinosa,
xylosa, rhamnosa dan manitol; dapat atau tidak
memfermentasi sukrosa, rafinosa, salisin, eskulin, dulsitol dan gliserol;
bervariasi dalam memfermentasi sakrosa dan
salisin, pektin dan adonitol jarang
difermentasikan; dekstrin, pati dan glikogen dan
inositol tidak pernah difermentasikan (Merchant dan Parker, 1961).
Escherichia
coli menghasilkan katalase, tidak
mencairkan gelatin, membentuk indol, mereduksi
nitrat, mengoksidasi dan mengasamkan air susu tanpa peptonisasi,
mengoksidasi kentang sehingga berwarna coklat gelap, tidak menghasilkan
gas H2S (Merchant dan Parker, 1961).
B. IDENTIFIKASI
1.
Sallmonella Sp.
Tujuan dari pengidentifikasian dalam
uji suatu bakteri (Salmonella) pada metode kualitatif adalah untuk
mengetahui mutu ataupun kualitas dari suatu produk makanan berdasarkan sifat
mikrobiologinya. Pengujian mikrobiologi pada sampel makanan akan selalu mengacu
kepada persyaratan makanan yang sudah ditetapkan.
Pada pengujan deteksi Salmonella diguanakan
Buffered Peptone Water (BPW) sebagai
media cair non selektif, Muller
Kaufimann Tetrathionate Novobiocin Broth (MKTTn) dan Rappaport Vassiliadis Medium + Soya (RVS) sebagai media cair
selektif, Bismuth Green Agar (BGA)
dan Xylose Lysine Deoxycholate (XLD)
sebagai media padat selektif untuk mengisolasi Salmonella.
Prinsip pengujian deteksi Salmonella menurut
Metode Analisis Mikrobiologi (MA PPOM 74/MIK/06) yaitu ada empat tahap untuk
mendeteksi adanya Salmonella :
-
Pra-Pengkayaan Non-Selektif
Dengan cara aseptic ditimbang 25 gram atau dipipet 25
ml cuplikan ke dalam kantong plastic stomacher steril ditambahkan 225 ml BPW.
Dihomogenkan menggunakan stomacher selama 30 detik dan diinkubasi pada suhu
37±1° C selama 18±2 jam.
-
Pengkayaan Selektif
Dengan cara aseptic dipipet biakan
pra-pengkayaan masing-masing 1ml ke dalam 10 ml MKTTn inkubasi pada suhu 37±1°C
selama 24±3 jam dan 0,1 ml ke dalam 10 ml RVS inkubasi pada suhu 41,5±1 °C
selama 24±3 jam. Jagalah agar maksimum suhu inkubasi tidak melebihi 42,5° C.
-
Inokulasi & identifikasi
Dari biakan MKTTn dan RVS
diinokulasikan masing-masing sebanyak 1 sengkelit pada permukaan BGA dan XLD,
kemudian diinkubasi pada suhu 37+1 °C selama 24+3 jam koloni yang tumbuh
diamati. Biakan Salmonella positif jika :
a. Dalam
media BGA : koloni dari tidak berwarna, merah muda hingga merah dan
translusen hingga keruh dengan lingkaran merah muda sampai merah.
b. Dalam
media XLD : koloni translusen dengan bintik hitam ditengah,
dan dikelilingi zona transparan berwarna kemerahan.
- Konfirmasi
Dipilih dua atau lebih koloni spesifik pada BGA dan
XLD diinokulasikan pada media TSA atau NA miring. Dari TSA atau NA miring
dilakukan uji konfirmasi sebagai berikut:
a) TSIA
Diinokulasikan koloni tersangka dengan cara tusuk dan
goresan pada media TSIA, inkubasi pada suhu 37+1° C selama 24+3 jam. Amati
perubahan warna yang terjadi. Munculnya endapan hitam menandakan pembentukan
Hidrogen Sulfida (menandakan keberadaan Sallmonella.)
b) Uji
Urease
Inokulasikan koloni tersangka pada media urea agar
(Christensen) suhu 37±1°C. Amati perubahan warna biakan yang terjadi. Uji
urease menunjukkan hasil positif jika terjadi perubahan warna dari kuning
menjadi merah keunguan.
c) Uji
Dekarboksilasi lysine
Inokulasikan koloni tersangka pada media L.Lysine
decarboxylase diikubasi pada suhu 37±1 °C selama 24±3 jam. Amati perubahan
warna biakan dan kekeruhan yang terjadi. Pada media ini, Salmonella akan
membentuk koloni merah dengan inti hitam.
d) Uji
Voges Proskauser
Inokulasikan koloni tersangka pada media MR-VP pada
suhu 37±1° C selama 24±3 jam. Tambahan 3 tetes larutan Alfa naftol dan 2 tetes
larutan KOH 40 %. Amati perubahan warna biakan yang terjadi setelah 15 menit.
Positif apabila muncul warna merah.
e) Uji
Indol
Inokulasikan koloni tersangka pada media Tryptone
Broth atau Tryptophan broth, pada suhu
37±1° C selama 24±3 jam. Tambahkan beberapa tetes larutan Kovac. Amati
perubahan cincin merah. Sallmonella tidak
akan membentuk cincin ini.
f) Uji
Serologi
Ambil 1 ose biakan dari TSA/NA miring suspensikan
dengan 1 tetes NaCl 0,85 % dan 1 tetes air, dan campurkan pada kaca objek.
Apabila diamati dengan latar belakang gelap dan menggunakan kaca pembesar telah
terjadi aglutinasi, sebaiknya tidak dilakukan uji serologi dengan antisera
(serum yang diteteskan untuk menguji) polivalen O, H, Vi, karena telah terjadi
aglutinasi sendiri (self agglutination). Apabila tidak terjadi
aglutinasi (penggumpalan) sendiri, lakukan uji serologi seperti diatas dengan
antisera polivalen O, H, dan Vi. Jika terjadi aglutinasi, maka Salmonella positif.
Uji ini dapat dilakukan pada kaca objek atau tabung kecil. Untuk antisera
polivalen H, biakan Salmonella diinokulasikan pada media NA semi
padat yang diinkubasi pada 37±1°C selama 24±3 jam. Makanan atau minuman tidak
boleh mengandung Salmonella (negative per 25 gram atau 25 ml)
(BPOM RI, 2006).
Pada
pengujian salmonella,
dibuat juga kontrol positif yaitu sampel yang telah diberi biakan kultur
salmonella sebagai pembanding. Dari pengkayaan selektif, biakan dari MKTTn dan
RVS diinokulasikanpada media BGA dan XLD untuk tahap inokulasi dan
identifikasi.
Salmonella positif jika
pada uji biokimia yang dilakukan hasilnya sebagai berikut:
ü TSIA : H2S
positif
ü Hidrolisis
urea : negative
ü Dekarbosilasi
lysine : positif
ü Reaksi voges
proskauer : negative
ü Produksi
indol : negative
ü Uji
serologi: terjadi aglutinasi pada penambahan antisera polivalen O, H, dan Vi
2. E.Coli
Berbagai
cara pengujian E. coli telah dikembangkan, tetapi analisis konvensional yang
masih banyak dipraktekkan adalah dengan 4 tahap analisis yang memerlukan waktu
5-7 hari. Empat tahap analisis tersebut adalah Uji Pendugaan dengan metode MPN
( most probable number ), Uji penguat pada medium selektif, Uji lengkap dengan
medium lactose broth, serta Uji Identifikasi dengan melakukan reaksi IMViC
(indol, methyl red, Vogues-Praskauer, dan citrate).
Jadi
untuk dapat menyimpulkan E. coli berada pada air atau makanan diperlukan
seluruh tahapan pengujian di atas. Apabila dikehendaki untuk mengetahui
serotipe dari E. coli yang diperoleh untuk memastikan apakah E.coli tersebut
patogen atau bukan maka dapat dilakukan uji serologi. Meskipun demikian,
beberapa serotipe patogen tertentu seperti O157:H7 yang ganas tidak dapat diuji
langsung dengan pengujian 4 tahap ini dan memerlukan pendekatan analisis khusus
sejak awal.
E. Coli
merupakan bakteri gram negatif, dan bisa juga diidentifikasi melalui pengujian
gram. Selain itu, pengujian yang bisa dilakukan adalah rangkaian uji IMViC.
Peralatan dan bahan yang digunakan dalam uji ini adalah sbb :
Peralatan :
a. Penangas
air
b. Waterbath
Inkubator 44-45oC
c. Pipet
Volume 1 mL, 10 mL
d. Ose
e. Labu
Erlenmeyer
f. Tabung
Reaksi
Perbenihan dan pereaksi
a. Eschericia
Coli Broth
b. BGLB
Broth, EMB Agar, MR-VP Medium dan Nutrient Agar (NA)
c. Larutan
Methyl Red
d. Pereaksi
Voges Proskauer
e. Pereaksi
untuk Pewarnaan Gram
f. Pereaksi
Indol
g. Larutan
alfa-Naphtol
h. Larutan
KOH 40%
1. Prosedur Pengujian Awal :
a) Masukkan
1 sengkelit biakan yang positif gas pada LB dan pengujian APM bakteri Coliform
kedalam tabung berisi E.C Broth yang di dalamnya terdapat tabung durham
terbalik.
b) Inkubasikan
dalam penangas air pada suhu 44-45oC selama 24-48 jam.
c) Catat
tabung yang didalamnya terbentuk gas (E.Coli dianggap positif, jika di dalam
tabung terbentukgas).
d) Lanjutkan
penetapan E.Coli dengan menginokulasikan biakan yang membentuk gas ke
perbenihan EMB atau VRBA dalam cawan petri.
e) Inkubasikan
pada suhu 37oC selama 18-24 jam.
f) Pilih
koloni berwarna merah gelap (VRBA) yang berdiameter 0,5 mm atau lebih atau
koloni berwarna kilat logam hijau metalik (EMB Agar) dan di inokulasikan pada
g) Nutrien
Agar miring dalam tabung, Inkubasikan pada suhu 35oC selama 18-24
jam.
Pada waktu yang
sama lakukan pewarnaan gram sebagai berikut :
a)
Buat sediaan diatas
kaca alas.
b)
Keringkan di udara dan
fiksasikan dengan panas.
c)
Rendam sediaan dengan
tetesan larutan cristal Violet ammonium Oxalate selama 1 menit.
d)
Cuci dengan air dan
tiriskan.
e)
Bubuhkan larutan Lugol
(Gram iodium) selama 1 menit.
f)
Cuci dengan air kran
dan tiriskan. Cuci (Hilangkan warna) dengan alkohol 95% selama 30 detik.
g)
Cuci dengan air kran,
tiriskan dan bubuhkan larutan safranin selama 10-30 detik.
h)
Cuci dengan air kran,
tiriskan, serap dengan kertas saring, keringkan dan periksa dibawah mikroskop.
2. Prodesur
Pengujian IMVIC :
a) Uji
Indol
Dari biakan
murni nutrien agar miring, inkubasikan 1 sengkelit Biakan kedalam Trypton
broth. Inkubasikan pada suhu 35oC selama 18-24 jam. Tambahkan 0,2-0,3 ml
pereaksi indol kedalam masing-masing tabung dan kocok selama 10 menit. Warna
merah tua pada permukaan menunjukkan reaksi indol positif. Warna jingga
menunjukkan reaksi indol negatif.
b) Uji
merah Methyl
Dari biakan
murni nutrien agar miring, inokulasikan 1 sengkelit biakan kedalam perbenihan
MR-VP. Inkubasikan pada suhu 35oC selam 48 jam. Dengan menggunakan pipet,
pindahkan 5 ml ke dalam tabung reaksi, tambahkan 5 tetes MM dan kocok. Warna
kuning menunjukkan reaksi negatif dan warna merah menunjukkan reaksi positif.
c) Uji
VP
Dari biakan
murni nutrien agar miring, inokulasikan 1 sengkelit biakan kedalam perbenihan
MR-VP. Inkubasikan pada suhu 36oC selama 48 jam. Dengan menggunakan pipet,
pindahkan 1 ml suspensi kedalam tabung, jtambahkan 0,6 ml larutan alfa-naphtol
dan 0,2 ml larutan KOH dan kocok. Diamkan selama 2-4 jam. Warna merah muda
hingga merah tua menunjukkan reaksi positif, warna tidak
berubah menunjukkan reaksi negatif.
BAB III
PENUTUP
A. KESIMPULAN
Metode analisa merupakan proses pembuktian atau konfirmasi pengujian secara
obyektif di laboratorium yang telah memenuhi persyaratan yang telah ditentukan
dan sesuai dengan tujuan penggunaannya. Dalam hal ini.
metode analisa yang digunakan untuk mengidentifikasi adanya bakteri Salmonella dan E.Coli metode yang
digunakan yakni metode analisa secara kualitatif yakni
bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya suatu bakterisalmonella dalam suatu makanan.
